黃芪甲苷對(duì)體外培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞影響的實(shí)驗(yàn)研究
     血管生成(angiogenesis)在人體正常組織臟器發(fā)育以及 疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。血管生成主要涉及 到內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移等過程。正常情況下這些過程受到 嚴(yán)密調(diào)控，而相對(duì)處于平衡狀態(tài)；但當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)某種疾病時(shí)， 這種平衡機(jī)制被某些因素所打破，造成血管生成的障礙。近 年來，針對(duì)疾病狀態(tài)下異常的血管新生已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外研 究的熱點(diǎn)。5／6腎切大鼠模型是慢性腎臟病進(jìn)行性進(jìn)展的經(jīng) 典動(dòng)物模型。在該大鼠模型中，內(nèi)皮細(xì)胞的受損及凋亡表現(xiàn) 突出，尤其在腎切8—12周時(shí)，凋亡的內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量有一個(gè) 加劇的過程。在這個(gè)階段里，如果加用某些藥物干預(yù)，則 可對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡起到一定的保護(hù)作用，并可以延緩慢 性腎臟病的進(jìn)展?，F(xiàn)已有眾多研究證明黃芪等中藥具有改 善內(nèi)皮細(xì)胞功能，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞修復(fù)及再生等藥理作用。 本實(shí)驗(yàn)研究以中藥血清藥理學(xué)為實(shí)驗(yàn)方法，從體外實(shí)驗(yàn)的 角度探討黃芪甲苷對(duì)以腎衰模型大鼠血清干預(yù)培養(yǎng)而受損 的內(nèi)皮細(xì)胞的影響。


1 材料與方法


1．1 藥品及試劑RPMI一1640培養(yǎng)基(美國(guó)GIBCO公司)； 胎牛血清(FCS，美國(guó)Hycolon公司)；四甲基偶氮唑鹽 (MTT，美國(guó)Sigma公司)；二甲基亞砜(DMSO)(天津市福晨 化學(xué)試劑廠)；黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)品并由l％羧甲基纖維素鈉溶解配成溶液。


1．2 儀器設(shè)備超凈工作臺(tái)(北京半導(dǎo)體設(shè)備一廠)；C02 細(xì)胞培養(yǎng)箱(日本三洋公司)；倒置顯微鏡(K70、CKX31日 本OLYMPUS公司)；數(shù)碼照相機(jī)(C7070 Et本OLYMPUS公 司)；酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio～Rad公司)；aeeu-jetpro移液槍(德國(guó) Ependof公司)；AL204電子天平(METFLER TOLEDO上海 有限公司)。


1．3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康雄性Wistar大鼠30只，體重250～ 320 g，SPF級(jí)(中科院上海藥物所提供)。


1．4 模型制備及各實(shí)驗(yàn)用血清的制備方法正常Wismr 大鼠30只，其中l0只正常血清組：飼養(yǎng)12周后處死采血， 以制備正常大鼠血清；10只腎衰模型血清組：適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，以Ormrod和Miller所采用的改良5／6腎切法，進(jìn)行 5／6腎切除手術(shù)，并飼養(yǎng)12周后處死取血，以制備腎衰模型 大鼠血清；10只黃芪甲苷給藥正常血清組：正常飼養(yǎng)12周 后，按以下方法以黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)品配制的溶液進(jìn)行灌胃，并 制備實(shí)驗(yàn)用黃芪甲苷給藥正常大鼠含藥血清。


1．5 HUVEC內(nèi)皮細(xì)胞系的復(fù)蘇從液氮中取出凍存HU— VEC細(xì)胞，快速解凍；將凍存細(xì)胞液L從凍存管中移出)加入 到裝有10ml的無(wú)血清培養(yǎng)液的小離心管中，輕輕混勻；離 一C~,(12oo rmp，5分鐘)；棄上清；加入10ml 10％培養(yǎng)液，反復(fù)吹打混勻；接種細(xì)胞到培養(yǎng)瓶(5m1)，置于37℃ C02溫箱中 培養(yǎng)。


1．6 M ITr法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖能力 收集對(duì)數(shù)期HUVEC細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，分于96 孔板，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1 x 104／孑L／100ul；置37℃ 、5％C02溫 箱以10％FCS的培養(yǎng)液培養(yǎng)，使細(xì)胞貼壁24小時(shí)；用無(wú)血 清培養(yǎng)液同步培養(yǎng)24小時(shí)；換上以不同的實(shí)驗(yàn)用血清配制 的細(xì)胞培養(yǎng)液各200 1／孔，繼續(xù)培養(yǎng)；共分三組：1)正常血 清組(10％正常大鼠血清+90％1640培養(yǎng)液)；2)腎衰血清 組(5％腎衰模型大鼠血清+5％正常大鼠血清+90％1640 培養(yǎng)液)；3)黃芪甲苷干預(yù)腎衰血清組(5％腎衰模型大鼠血 清+5％黃芪甲苷含藥大鼠血清+90％1640培養(yǎng)液)。觀察 12，24，48小時(shí)3個(gè)時(shí)問點(diǎn)的各組細(xì)胞增殖的能力；小心吸 去上清，PBS輕輕洗滌，再次棄上清；每孔加入100ul新鮮 培養(yǎng)液，再加入20ul 5％的MTF溶液，繼續(xù)培養(yǎng)3 h；終止培 養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液；每孔加入100ul二甲基亞砜 (DMSO)，置溫箱中5rain，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫 檢測(cè)儀490nm處測(cè)量各孔的吸光值；同時(shí)，每個(gè)時(shí)問點(diǎn)設(shè) 置二個(gè)調(diào)零孑L(培養(yǎng)基、Mr丌、二甲基亞砜)，每實(shí)驗(yàn)組沒定 6復(fù)孔。


1．7 內(nèi)皮細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)(劃痕實(shí)驗(yàn))檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 取HUVEC細(xì)胞按每孔1 x l05／500 I接種于24孔 板；正常培養(yǎng)24小時(shí)后棄去培養(yǎng)液，換上只含有0．5％FCS 的培養(yǎng)液，各孔500ul，持續(xù)24小時(shí)以達(dá)到細(xì)胞同步化；換 上以不同的實(shí)驗(yàn)用血清配制的細(xì)胞培養(yǎng)液各500 1／孑L，實(shí) 驗(yàn)分組同上；用單位為100“1的移液器滴頭在每個(gè)孔中沿 培養(yǎng)板底部呈”一”字形劃痕，在100倍倒置顯微鏡下每 孔任意選取3個(gè)視野照相以記錄劃痕區(qū)的相對(duì)距離；按 500 1／孔加入不同血清配制的培養(yǎng)液，每個(gè)組設(shè)3個(gè)復(fù)孔， 繼續(xù)培養(yǎng)；18小時(shí)后，照相并記錄加藥后劃痕區(qū)的相對(duì)距 離，并計(jì)算各組細(xì)胞平均遷移距離，并計(jì)算其細(xì)胞遷移率。


1．8 統(tǒng)計(jì)方法以SPSS15．0統(tǒng)計(jì)軟件行統(tǒng)計(jì)分析，使用均 數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±S)描述，正常血清組與腎衰血清組之間， 以及腎衰血清組與黃芪甲苷干預(yù)’腎衰血清組之間分別以獨(dú) 立樣本資料￡檢驗(yàn)(Independent—Sample T Test)統(tǒng)計(jì)方法實(shí) 現(xiàn)，以P
2 結(jié)果


2．1 MTT檢測(cè)結(jié)果


與正常血清組比較，在不同組血清培養(yǎng)12小時(shí)以及 24小時(shí)時(shí)，三組血清的MTT吸光度值無(wú)明顯差異(P>0． 05)；在繼續(xù)培養(yǎng)干預(yù)到48小時(shí)時(shí)，腎衰血清組MTT吸光 度較止常血清組顯著降低(P<0．01)。與腎衰血清組相比，黃芪甲苷干預(yù)腎衰血清組M1Tr吸光度值有所提高(P<0．05)。


2．2 內(nèi)皮細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)(劃痕實(shí)驗(yàn))檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 與正常血清組比較，腎衰血清組在培養(yǎng)18小時(shí)后細(xì)胞 的遷移率明顯降低(P<0．01)；而黃芪甲苷干預(yù)腎衰血清組 的細(xì)胞遷移率較腎衰血清組明顯升高(P<0．01)。(見表2)


3 討論


根據(jù)中醫(yī)理論，黃芪是通過益氣扶正等機(jī)制保護(hù)腎臟， 從而延緩。圩功能的進(jìn)展及其進(jìn)行性惡化?！端貑?middot;通評(píng)虛實(shí) 論》說：“精氣奪則需”。慢性。腎臟病病程纏綿，久病多虛，及 至慢性腎衰，其虛損之程度必然更重，臨床可表現(xiàn)為腰酸腰 痛、神疲乏力、面色痿黃或無(wú)華等癥。因此，治病求本、扶助 正氣是治療該病的主線。黃芪味甘，性微溫，歸脾、肺經(jīng)。有 益氣扶陽(yáng)利尿之功，補(bǔ)氣之力甚佳，為治療氣虛倦怠的要 藥?！侗窘?jīng)逢原》日該藥“能補(bǔ)五臟諸虛”。


本實(shí)驗(yàn)從黃芪的主要有效成分一一黃芪甲苷人手，以中 藥血清藥理學(xué)及體外培養(yǎng)HUVEC細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)方法，提示 該有效成分可以通過改善受損內(nèi)皮細(xì)胞的增殖能力及遷移 能力等途徑，在一定程度上起到修復(fù)內(nèi)皮細(xì)胞的作用；從而 更進(jìn)一步地揭示，該藥能通過保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞而達(dá)到保 護(hù)殘存腎單位，而延緩慢性腎臟病的進(jìn)展。