樣品實驗方案

簡要概述

1. 在生長培養(yǎng)基中準(zhǔn)備細胞

2. 添加MP染料工作液

3. 在室溫下孵育30至60分鐘

4. 檢測添加膜電位后化合物的熒光變化

溶液配制

儲備溶液配制

1.分析緩沖液原液（1X）：將1 mL的10X分析緩沖液（組分B）添加到9 mL的HHBS中（組分C，不包括#36001），并充分混合。 注意：10 mL的1X分析緩沖液足以用于1個板。

工作溶液配制

將15 uL的MP Sensor（組分A）添加到10 mL的1X 分析緩沖液儲備溶液中并充分混合。 該工作溶液在室溫下穩(wěn)定至少兩個小時。

實驗步驟

1.將100 µL /孔（96孔板）或25 µL /孔（384孔板）MP染料工作溶液添加到細胞板中。注意：如果您的篩選化合物干擾了生長培養(yǎng)基和血清因子，那么在添加MP染料工作溶液之前，用等體積的HHBS緩沖液替換生長培養(yǎng)基?；蛘?，細胞可以在無血清條件下生長。注意：上色后請勿清洗細胞。

2.在細胞培養(yǎng)箱中孵育工作溶液板30分鐘。注意：在某些情況下，在室溫下孵育30至60分鐘可能會更好。

3.通過使用HHBS或所需的緩沖液來準(zhǔn)備復(fù)合板。

4.在加入化合物的前后，使用熒光酶標(biāo)儀中的內(nèi)置液體處理器，通過檢測Ex / Em = 530/570 nm處的熒光來運行膜電勢測定。注意：在實驗之前進行信號測試非常重要，不同的儀器具有各自的強度范圍。將信號測試強度調(diào)整為大儀器強度計數(shù)的10％到15％。例如，F(xiàn)LIPR-384的大熒光強度計數(shù)為65,000，因此應(yīng)調(diào)整儀器設(shè)置，使其信號測試強度約為7,000至10,000。

圖示

圖1.用P2X受體瞬時轉(zhuǎn)染的HEK細胞中的ATP劑量反應(yīng)。 用P2X受體瞬時轉(zhuǎn)染的HEK細胞以40,000個細胞/ 100 µL /孔的速度在Costar黑墻/透明底部96孔板中過夜接種。 將細胞與100 µL MP染料上載溶液在5％CO2、37°C的培養(yǎng)箱中孵育60分鐘。 FlexStation添加了ATP（50 µL /孔）以達到指示的濃度。 用底部讀取模式在Ex / Em = 530/570 nm（在550 nm處截止）下測量熒光信號。