士鋒生物結(jié)晶紫染色法測(cè)定細(xì)胞數(shù)

時(shí)間：2014/8/21閱讀：759

1．在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板各孔中加0.1ml含5×104～10×4 WEHI-164細(xì)胞的培養(yǎng)液（含10％小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液），37℃ 5％ CO2的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3小時(shí)，讓細(xì)胞帖壁。

2．用RPMI-1640培養(yǎng)液10倍遞次稀釋TNF標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)需要3～5倍遞次稀釋待檢樣品，每孔加0.1ml稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品或待檢樣品，每個(gè)稀釋度3個(gè)重復(fù)孔。對(duì)照孔6個(gè)，3個(gè)陽(yáng)性對(duì)照孔各加0.1ml含4μg TNF的RPMI-1640培養(yǎng)液，3個(gè)陰性對(duì)照孔各加100μl RPMI-1640培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)18～24小時(shí)。

3．甩去培養(yǎng)液，用PBS小心洗滌一次，每孔加0.1ml 10％甲醇溶液固定細(xì)胞30秒鐘。

4．吸去甲醇溶液，每孔加0.1ml結(jié)晶紫染液，室溫中放置20分鐘。

5．輕輕甩去染色液，用蒸餾水洗滌各孔，將培養(yǎng)板倒置于吸水紙上吸干水分。自然干燥或37℃烘干。此板可以在室溫中保存。

6．測(cè)定前，每孔加0.1ml 33％醋酸脫色，充分振蕩后在570nm處測(cè)定光吸收度。用光吸收度（OD）值對(duì)樣品稀釋度作圖，比較標(biāo)準(zhǔn)品曲線和待檢樣品曲線即可得到待測(cè)樣品中的細(xì)胞因子活性

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