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上海士鋒生物科技有限公司
中級會(huì)員 | 第14年

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標(biāo)準(zhǔn)品
培養(yǎng)基
培養(yǎng)基原料 霍亂弧菌診斷血清 大腸艾希氏菌診斷血清 志賀氏菌屬診斷血清 沙門氏菌屬診斷血清 標(biāo)準(zhǔn)血清,診斷血清 抗生素藥敏紙片 微生物配套試劑 微生物生化管 管裝培養(yǎng)基 即用型液體培養(yǎng)基 一次性培養(yǎng)基平板 顯色培養(yǎng)基 臨床培養(yǎng)基 菌種保存培養(yǎng)基 四環(huán)素檢定、厭氧亞硫酸鹽還原桿菌檢測培養(yǎng)基 維生素檢測培養(yǎng)基 一次性衛(wèi)生用品衛(wèi)生檢測培養(yǎng)基 罐頭食品商業(yè)無菌檢測培養(yǎng)基 飲用水及水源檢測培養(yǎng)基 藥品、生物制品檢測培養(yǎng)基 化妝品檢測培養(yǎng)基 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基 啤酒檢驗(yàn)培養(yǎng)基 軍團(tuán)菌檢測培養(yǎng)基 支原體檢測培養(yǎng)基 小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌檢驗(yàn)培養(yǎng)基 彎曲桿菌檢驗(yàn)培養(yǎng)基 產(chǎn)氣莢膜梭菌、肉毒梭菌、厭氧菌檢驗(yàn)培養(yǎng)基 阪崎腸桿菌檢驗(yàn)培養(yǎng)基 溶血性鏈球菌檢測培養(yǎng)基 李斯特氏菌檢測培養(yǎng)基 弧菌檢測培養(yǎng)基 乳酸菌、雙歧桿菌檢測培養(yǎng)基 酵母、霉菌檢測培養(yǎng)基 檢測培養(yǎng)基 沙門氏菌、志賀氏菌檢驗(yàn)培養(yǎng)基 大腸菌群、糞大腸菌群、大腸桿菌及腸桿菌科檢測培養(yǎng)基 細(xì)菌總數(shù)檢測,增菌培養(yǎng)基
抗體
生物試劑
細(xì)胞
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血清
細(xì)胞分離試劑
試劑盒

CaCl2感受態(tài)細(xì)胞的制備的實(shí)驗(yàn)步驟

時(shí)間:2016/5/9閱讀:992
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CaCl2感受態(tài)細(xì)胞的制備的實(shí)驗(yàn)步驟 
1.前夜接種受體菌( DH5α或 DH10B),挑取單菌落于lb培養(yǎng)基中37℃搖床培養(yǎng)過夜(約16小時(shí)); 
2.取 1ml過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接于100ml LB培養(yǎng)基中,在37℃搖床上劇烈振蕩培養(yǎng)約2.5-3小時(shí)(250-300rpm); 
3.將 0.1M CaCl2溶液置于冰上預(yù)冷; 
以下步驟需在超凈工作臺(tái)和冰上操作 
4.吸取 1.5ml培養(yǎng)好的菌液至1.5ml離心管中,在冰上冷卻10分鐘; 
5.4℃下3000g冷凍離心5分鐘; 
6.棄去上清,加入 100μl預(yù)冷0.1M CaCl2溶液,用移液槍輕輕上下吸動(dòng)打勻,使細(xì)胞重新懸浮,在冰放置20分鐘; 
7.4℃下3000g冷凍離心5分鐘; 
8.棄去上清,加入 100μl預(yù)冷0.1M CaCl2溶液,用移液槍輕輕上下吸動(dòng)打勻,使細(xì)胞重新懸?。?nbsp;
9.細(xì)胞懸浮液可立即用于轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)或添加冷凍保護(hù)劑( 15% - 20%甘油)后超低溫冷凍貯存?zhèn)溆茫ǎ?0℃)。 

·電轉(zhuǎn)化法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)步驟 
1.前夜接種受體菌( DH5α或 DH10B),挑取單菌落于LB培養(yǎng)基中37℃搖床培養(yǎng)過夜; 
2.取 2ml過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接于200ml LB培養(yǎng)基中,在37℃搖床上劇烈振蕩培養(yǎng)至OD600=0.6(約2.5-3小時(shí)); 
3.將菌液迅速置于冰上。以下步驟務(wù)必在超凈工作臺(tái)和冰上操作 
4.吸取 1.5ml培養(yǎng)好的菌液至1.5ml離心管中,在冰上冷卻10分鐘; 
5.4℃下3000g冷凍離心5分鐘; 
6.棄去上清,加入 1500μl冰冷的10%甘油,用移液槍輕輕上下吸動(dòng)打勻,使細(xì)胞重新懸?。?nbsp;
7.4℃下3000g冷凍離心5分鐘 
8.棄去上清,加入 750μl冰冷的10%甘油,用移液槍輕輕上下吸動(dòng)打勻,使細(xì)胞重新懸?。?nbsp;
9.4℃下3000g冷凍離心5分鐘 
10.加入 20μl冰冷10%的甘油,用移液器輕輕上下吸動(dòng)打勻,使細(xì)胞重新懸?。?nbsp;
11.立即使用或迅速置于 -70℃超低溫保存。 
附注: 
影響感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率的因素及實(shí)際操作過程中應(yīng)注意的事項(xiàng): 
1.細(xì)菌的生長狀態(tài):實(shí)驗(yàn)中應(yīng)密切注視細(xì)菌的生長狀態(tài)和密度,盡量使用對數(shù)生的細(xì)胞(一般通過檢測OD600來控制。DH5α菌株 OD600為 0.5 時(shí)細(xì)胞密度是 5 × 107/ml ); 
2.所有操作均應(yīng)在無菌條件和冰上進(jìn)行; 
3.經(jīng) CaCl2處理的細(xì)胞,在低溫條件下,一定的時(shí)間內(nèi)轉(zhuǎn)化率隨時(shí)間的推移而增加, 24小時(shí)達(dá)到zui高,之后轉(zhuǎn)化率再下降(這是由于總的活菌數(shù)隨時(shí)間延長而減少造成的); 
4.化合物及無機(jī)離子的影響:在 Ca2+的基礎(chǔ)上聯(lián)合其他二價(jià)金屬離子(如 Mn2+或 Co2+ )、 DMSO 或還原劑等物質(zhì)處理細(xì)菌,可使轉(zhuǎn)化效率大大提高( 100-1000 倍); 
5.所使用的器皿必須干凈。跡量的去污劑或其它化學(xué)物質(zhì)的存在可能大大降低細(xì)菌的轉(zhuǎn)化效率; 
6.質(zhì)粒的大小及構(gòu)型的影響:用于轉(zhuǎn)化的應(yīng)主要是超螺旋的 DNA ; 
7.一定范圍內(nèi),轉(zhuǎn)化效率與外源 DNA 的濃度呈正比;

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