參照NCBI公布的小反芻獸疫病毒疫苗株Nigeria75/1全基因序列(GenBank登錄號：X74443),人工合成表達(dá)核蛋白的N基因開放閱讀框序列并將其插入載體pBluescriptsk,通過PCR擴(kuò)增,將N基因克隆至pMD19-T載體,經(jīng)引物設(shè)計(jì)引入的EcoR Ⅰ和Kpn Ⅰ特異性酶切,將N基因克隆于昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體pFastBacHTA,陽性重組質(zhì)粒命名為pFastBacHTA-PPRV-N,測序結(jié)果顯示克隆基因片段長度為1578bp,編碼525個氨基酸。

將pFastBacHTA-PPRV-N轉(zhuǎn)化含有桿狀病毒穿梭載體的DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞,得到重組穿梭質(zhì)粒Bacmid-PPRV-N,在脂質(zhì)體介導(dǎo)下用Bacmid-PPRV-N轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞,獲得表達(dá)PPRV N蛋白的重組桿狀病毒VBacmid-PPRV-N。 SDS-PAGE和Western blot分析結(jié)果表明該蛋白得到表達(dá),且具有良好的生物活性,分子量大小約為61.3ku。以純化的Bacmid-PPRV-N重組蛋白為抗原免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的致敏脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞在PEG作用下融合,經(jīng)克隆培養(yǎng)和間接ELISA方法篩選,獲得了2株能穩(wěn)定分泌抗小反芻獸疫病毒N蛋白抗體的雜交瘤細(xì)胞株,分別命名為5B11和3H10-3B8。生物學(xué)特性鑒定試驗(yàn)表明：5B11和3H10-3B8抗體類型和亞類均為IgG2b；5B11單抗腹水的效價(jià)達(dá)1：819200,3H10-3B8達(dá)1：12800；血清學(xué)試驗(yàn)證明2株單抗均能與Bacmid-PPRV-N重組蛋白抗原結(jié)合,具有高度的特異性；相加ELISA試劑盒試驗(yàn)結(jié)果顯示,5B11和3H10-3B82株單克隆抗體分別識別N蛋白上不同的抗原位點(diǎn)；2株雜交瘤細(xì)胞的染色體均為99-104。以Bacmid-PPRV-N重組蛋白和用親和層析純化的單抗5B11建立了小反芻獸疫病毒C-ELISA抗體檢測方法。

通過檢測已知為PPRV抗體陽性和陰性的血清對該方法進(jìn)行條件優(yōu)化,zui終確定抗原用碳酸鹽緩沖液以1：1000稀釋后包被酶標(biāo)板,于37℃條件下震蕩反應(yīng),以含0.5%BSA和0.05%Tween-20的PBS作為稀釋液,稀釋血清至1：10、單抗至0.17ng/孔的終濃度后一起加到酶標(biāo)板,使單抗與血清中的PPRV抗體競爭結(jié)合N抗原特異性表位,檢測結(jié)果的臨界值通過92份已知為PPRV抗體陰性血清的抑制率分布來確定,zui終將臨界值確定為50,即92份陰性血清的PI均值加上3倍的標(biāo)準(zhǔn)偏差。基于上述研究成果,先后組裝了3個批次的試劑盒。在試劑盒的初步應(yīng)用中,將自制的試劑盒與通用的標(biāo)準(zhǔn)試劑盒(CIRAD-BIOS PPRV rC-ELISA試劑盒)進(jìn)行比較分析,對自制的PPRV C-ELISA抗體檢測試劑盒的使用價(jià)值進(jìn)行了評估。通過對977份臨床樣品進(jìn)行檢測,結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析表明：自制的試劑盒與參考試劑盒的符合率為99.38%,說明自制的PPRVC-ELISA抗體檢測試劑盒可用于PPR臨床檢測。