利用合成的*抗原(BSA-ENR)免疫小鼠,通過細(xì)胞融合技術(shù)和間接競爭ELISA篩選出了能分泌*單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株,以此為基礎(chǔ)研制*殘留檢測的競爭ELISA試劑盒(competitive ELISA ENR-Kit),并測定其性能。結(jié)果表明:篩選出的2株雜交瘤細(xì)胞,單抗亞類均為IgG1型,其中4G1-B3株的ENR mAb間接ELISA效價為1:1.024×106,親和常數(shù)(Ka)為9×1010L/mol;競爭ELISA試劑盒的線性檢測范圍為0.05~101.6μg/L、靈敏度0.05μg/L、半數(shù)抑制濃度(IC50)1.1μg/L,與其他化合物的交叉反應(yīng)率(CR%)均小于0.01%,雞肉樣、雞肝樣、魚肉樣和牛奶樣的平均添加回收率分別為81.5%8、7.6%、84.3%和95%,不同基質(zhì)添加*標(biāo)準(zhǔn)品做競爭ELISA對ENR-Kit檢測結(jié)果影響小,試劑盒保存期6個月以上。結(jié)果說明該競爭ELISA試劑盒具有快速、敏感、特異、簡便等特點(diǎn),適用于ENR殘留的快速檢測。

ELISA測定親和常數(shù),其中4G1-B3株的親和常數(shù)為9×1010L/mol,4G1-G1株的親和常數(shù)為4·5×1010L/mol,結(jié)果見圖1,依據(jù)抗體親和力理論[13,14],親和力較好。Ig亞類鑒定為IgG1亞型。選擇親和常數(shù)zui大的4G1-B3株制備的腹水研制競爭ELISA試劑盒。圖1　*單抗的親和常數(shù)測定曲線Fig.1　Association constant (Ka) curve of ENR mAb2·2　競爭試劑盒的性能參數(shù)2·2·1　ENR mAb與HRP-ENR工作濃度　方陣滴定結(jié)果顯示,ENR mAb的*工作濃度為1∶128000;HRP-ENR的*工作濃度為1∶1000。2·2·2　靈敏度和標(biāo)準(zhǔn)曲線　ENR mAb對ENR的抑制曲線如圖2所示,回歸方程Y=-0·2538X+0·5095,相關(guān)系數(shù)R2=0·9913。競爭ELISA檢測20個空白標(biāo)準(zhǔn)品,所得平均值為1·02

ENR的*工作濃度為1∶1000。2·2·2　靈敏度和標(biāo)準(zhǔn)曲線　ENR mAb對ENR的抑制曲線如圖2所示,回歸方程Y=-0·2538X+0·5095,相關(guān)系數(shù)R2=0·9913。競爭ELISA檢測20個空白標(biāo)準(zhǔn)品,所得平均值為1·02,標(biāo)準(zhǔn)差為0·085;LOD為(B0-2s)/B0的值所對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線的*濃度,代入曲線回歸方程計算出LOD=0·05μg/L,即ENR-Kit的靈敏度為0·05μg/L。ENR-Kit的線性檢測范圍為0·05~101·6μg/L。根據(jù)回歸方程計算出ENR mAb對ENR的半數(shù)抑制濃度IC50為1·1μg/L。圖2　ENR-4G1-B3單抗對ENR的抑制曲線Fig.2　Inhibitory curve of 4G1-B3 mAb2·2·3　特異性　由表1可知,*與其他沙星類化合物以及其他常用抗生素類化合物的交叉反應(yīng)率均小于0·01%

90·5%~98·4%,平均95%,CV為4·6%~9·5%,平均6·8%。說明ENR-Kit具有較高的準(zhǔn)確度。2·2·5　基質(zhì)效應(yīng)性　如圖3所示5種基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的IC50分別是:PBS處理液為1·1μg/L、牛奶樣處理液為1·45μg/L、雞肝樣品處理液為2·0μg/L、雞肉樣處理液為2·61μg/L、魚肉樣處理液為2·94μg/L。結(jié)果說明,盡管不同生物基質(zhì)對標(biāo)準(zhǔn)品的吸光值有一定影響,但其IC50變化不大,對ENR-Kit的敏感性和檢測結(jié)果影響不大,可見上述樣品的處理方法是可行的。901　6期抗*單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的篩選及競爭ELISA試劑盒的研制