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上海雅吉生物科技發(fā)展公司

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熒光素標記整合素樣金屬蛋白酶與*1型-12抗體IgG

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  • 上海雅吉生物科技發(fā)展公司
  • 2016-09-22 02:11:25
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【簡單介紹】

YSF-1385R,熒光素標記整合素樣金屬蛋白酶與*1型-12抗體IgG,Anti-ADAM-TS12/FITC
貨號,中英文如上,更多抗體,標記抗體,免疫組化抗體,免疫組化試劑盒等咨詢:(高杰)

【詳細說明】

標記抗體:熒光素標記整合素樣金屬蛋白酶與*1型-12抗體IgG
1.用無水DMSO配制10mg/ml*N-羥基琥珀酰亞胺酯溶液。

2.用硼酸鹽緩沖液(0.1mol/L, pH8.8)配制濃度至少為1~3mg/ml的抗體溶液,若抗體儲存時加入了疊氮鈉,則標記前須先在硼酸鹽緩沖液中充分透析以除去疊氮鈉。

3.按25~100μg/mg的比率將*酯加入抗體中,混合均勻并在室溫下孵育4h。在完成結(jié)合反應(yīng)之前DMSO的終濃度不能低于5%,否則*酯會出現(xiàn)沉淀。高濃度的*酯會導(dǎo)致多個*分子結(jié)合在抗體上,因此可能會使所有抗體都被標記。較低的比率則會是使*化保持在zui低限度(25μg*酯/mg抗體的zui初摩爾比為10:1)。

4.每250μg*酯內(nèi)加入20μl 1mol/L的氯化銨,室溫孵育10min。

5.將抗體溶液用PBS或其他所需的緩沖液透析,以除去未結(jié)合的*。由于*分子較大,故透析比預(yù)料中的要慢,或者用蛋白A或蛋白G層析柱再次純化抗體。

6.按純化抗體的儲存方法保存標記抗體。
熒光素標記整合素樣金屬蛋白酶與*1型-12抗體IgG
,放射性碘標記抗體

1.在碘標記之前,準備氯甘脲包被的試管(2支6mm堿性玻璃管或1.5ml圓錐形試管)。將氯甘脲溶于濃度為0.5μg/ml的氯仿中。再將其分別加至試管中,每管100μl和20μl。讓氯仿在通風(fēng)櫥中揮發(fā)過夜。室溫儲存試管于干燥器中,可保存數(shù)年。包被有20μl氯甘脲的試管碘化效率較低,如果在平常的碘化反應(yīng)時引起抗體受損,則可用此試管。

2.在即將開始碘化反應(yīng)之前,準備好分離標記抗體的凝膠層析柱。使用排阻限度為20 000~50 000供分離球形蛋白分子的凝膠介質(zhì)。選用中等粒度的凝膠微柱(直徑約100μm)。依照說明書準備裝有1ml體積凝膠微柱的濾柱,濾柱在標記之后將丟棄,故應(yīng)選擇適合的濾柱。為了使碘化蛋白的非特異性結(jié)合減少到zui低,濾紙應(yīng)先用至少10倍體積的含0.02
疊氮鈉的1% BSA/PBS淋洗,然后再用10倍體積的PBS淋洗濾柱以除去BSA?;蛘哂煤珺SA的緩沖液膨脹凝膠粒,使用前再洗去BSA。讓濾柱內(nèi)緩沖液流出直至剛好低于柱床頂部,關(guān)閉凝膠柱底部的閥門或用塑膜黏土塞住膠柱末端。

3.在進行碘化反應(yīng)之前即時準備“終止”管,用于終止氧化反應(yīng)及滯留未參與結(jié)合反應(yīng)的剩余碘。于1.5ml錐形試管中加入50μl氯甘脲終止緩沖液(10mg/ml飽和的*、10%甘油和含0.1%二甲苯氰醇的PBS)。

4.室溫下在通風(fēng)櫥內(nèi)向氯甘脲包被管中加入50μl抗體。抗體用0.5mol/L磷酸鈉緩沖液(pH7.5)配制,濃度為0.2~1mg/ml。

5.于有抗體的氯甘脲試管中加入500μCi Na,將吸液頭丟入專門盛放廢棄125I材料的容器中。孵育2min,時間可稍延長,但可能會增加抗體的氧化損傷。

6.用巴斯德移液管將試管中液體移至盛有50μl氯甘脲終止緩沖液的試管中,輕輕混合。將巴斯德移液管和氯甘脲包被管丟于放射性廢物容器中。

7.小心將終止管中的反應(yīng)混合物加到濾柱內(nèi),并將移液管丟于放射性廢物容器中。

8.放開濾柱的閥門,開始收集洗脫液于1.5ml錐形試管中。在碘標記蛋白流入凝膠微珠內(nèi)后,向濾柱內(nèi)小心加入0.3ml含0.02%疊氮鈉PBS。繼續(xù)收集洗脫液于*管中。當緩沖液到達凝膠微珠頂部時,換用第二支錐形試管,然后再向濾柱內(nèi)加入0.3ml含0.02%疊氮鈉的PBS,再收集洗脫液。繼續(xù)重復(fù)上述洗脫步驟。用微型檢測儀監(jiān)測各管中125I標記抗體和游離標記物的波峰。抗體應(yīng)出現(xiàn)在第2~4洗脫組分,明顯早于藍色的二甲苯藍氰醇,后者與游離標記物一道洗脫。

9.將含有碘化抗體的洗脫組分合并。將未參與結(jié)合反應(yīng)的標記物連同整個濾柱丟于放射性廢物容器中。

10.  標記抗體可儲存于1% PBS/BSA洗脫緩沖液中,放4℃保存。雖然抗體比較穩(wěn)定,但放射性碘并不穩(wěn)定。因此,標記抗體應(yīng)在6周內(nèi)使用。
,生物合成法標記單克隆抗體

1.標記時雜交瘤細胞須生長旺盛、快速增殖。離心(3000g,10min收集大約2×106個細胞。

2.用37℃預(yù)溫的不含蛋氨酸的培養(yǎng)基重懸細胞,洗滌一次,再離心300g,10min。

3.用不含蛋氨酸的培養(yǎng)基重懸細胞至大約106/ml。加入[35S]蛋氨酸(每次標記用100μCi)可獲得放射性強度約為105~106cpm的抗體。

4.于CO2培養(yǎng)箱中37℃孵育過夜。

5.將細胞懸液以1000g離心10min,得到密集的細胞沉淀。棄去上清液。加入1/20體積的1mol/L Tris(pH8.0)和疊氮鈉至0.02%。)

熒光色素標記抗體

1.準備好凝膠濾柱以便完成結(jié)合反應(yīng)后用于分離標記抗體和游離的熒光色素。分離球形蛋白使用排除極限為20 000~50 000的凝膠介質(zhì)和細粒級凝膠(直徑約50μm)。所需凝膠濾柱的大小可根據(jù)偶聯(lián)反應(yīng)的總體積×20來確定。依據(jù)廠家說明準備好濾柱,用20倍柱床體積的 PBS灌注濾柱,直至緩沖液水平剛好降至低于柱床頂部,關(guān)閉濾紙底部的閥門或用塑膜黏土(或parafilm)封閉底端以使濾柱不再流動。

2.用0.1mol/L的硼酸鈉或碳酸鈉配制濃度至少為2mg/ml的抗體溶液(pH9.0)。應(yīng)避免引入含一級胺的外來分子。

3.用無水DMSO(優(yōu)級純)溶解FITC或TRITC至1mg/ml。每次標記反應(yīng)時新鮮配制。

4.每1ml蛋白溶液加50μl染液。染液須以每次5μl緩慢加入,加入時應(yīng)輕輕地連續(xù)攪拌混勻。

5.置4℃避光反應(yīng)1h。

6.加氯化銨至50mmol/L,室溫孵育2h。加入0.1%二甲苯氰和5%甘油。

7.通過凝膠過濾分離結(jié)合物與未結(jié)合的染料。小心地將偶聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)物加在濾柱頂部,打開閥門使抗體溶液流過濾柱直至剛好進入柱床。再小心地將PBS加在濾柱頂部并與緩沖液供應(yīng)裝置連接。結(jié)合染料的抗體首先洗脫,通常可在室光下見到。

8.將洗脫液的結(jié)合物4℃貯存于避光容器,必要時加入0.02%疊氮鈉。

9. 進行熒光素偶聯(lián)反應(yīng)時,應(yīng)通過測量495nm和280nm波長的吸光值計算熒光素和蛋白的比率,羅丹明的測量波長在550nm和280nm。熒光素的吸光 值比例(496nm/280nm)應(yīng)在0.3~1.0之間,羅丹明的吸光值比率(550nm/280nm)在0.3~0.7之間。低于上述比率將導(dǎo)致低信 號,高比率則出現(xiàn)高背景。若比率太低,應(yīng)使用低濃度抗體與高濃度染料重復(fù)結(jié)合;若比率太高,則可適當調(diào)整后重新標記,或通過DEAE離子交換層析柱進一步 純化抗體。用10mmol/L 磷酸鉀(pH8.0)平衡并灌注濾柱,通過增加鹽濃度進行梯度洗脫。測量每一組分的吸光值比率(495/280或550/280)。

    
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