自動 DNA 序列分析技術(shù)

1 混合反應(yīng)物
（1）取2.5μl 純化好的PCR 產(chǎn)物［相對于2.5μl 測序試劑盒中的pGEM-3Zf（＋）DNA］，
進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。
（2）凝膠用溴化乙錠染色，用流水沖洗脫色后，在紫外光下進(jìn)行照相記錄。參照pGEM-3Zf
（十）DNA 估測待測DNA 模板的濃度，以確定測序反應(yīng)中應(yīng)取的模板量。
（3）在一個標(biāo)記的 0.5ml Eppendorf 管中，混合以下反應(yīng)物：
DNA 模板 適量
引物（10pmol／ml） 0.5μl
加水至 5.25μl 或6.0μl（FSKit）
100℃下變性2 分鐘，再冰浴2 分鐘后短暫離心，然后加：
DyeDeoy TM Terminator Cycle Sequencing Kit 中測序液 4.75μl
或 FS-DNA Sequencing Kit 中測序液 4.0μl
終體積 10μl
（4）用微量取樣器將反應(yīng)物充分混合后，加 20μl 石蠟油覆蓋。
2 熱循環(huán)反應(yīng)
該反應(yīng)中降溫時間非常關(guān)鍵（約1℃／s）。因此，可使用Perkin-Elmer 序列的熱循環(huán)儀
（PCR 儀，如 480，2400 或 9600）。以下所描述的操作均基于Perkin-Elmer Model 480 熱
循環(huán)儀。將反應(yīng)管放入熱循環(huán)儀中，按以下程序進(jìn)行熱循環(huán)反應(yīng)：
（1）96℃ 1 秒鐘
96℃ 30 秒鐘
（2）50℃ 1 秒鐘
140 遺傳多樣性研究的原理與方法
50℃ 1 分鐘
（3）60℃ l 秒鐘
60℃ 4 分鐘
共需25 個循環(huán)。
3 純化測序產(chǎn)物
純化測序產(chǎn)物的方法是使用Princeton Separations Inc 的Centri SeP 柱（＃
CS-901）。操作過程如下：
（1）輕彈柱，使Cephadex G-50 膠粉從柱底部揚起。
（2）移去柱上蓋，加入 800μl 去離子水，再蓋上蓋振蕩，以除去氣泡。
（3）在室溫下放置30 分鐘，以水化凝膠柱。
（4）移去柱上蓋和下蓋，將凝膠柱放入一個配置好的洗脫管中，讓多余液體流出。
（5）倒去液體，將柱連同洗脫管一起在 3 000r／min 下離心 2 分鐘。
（6）將柱放入一個1.5ml 離心管中，用微量取樣器將測序反應(yīng)物取出，注在凝膠柱中
央。注意避免帶入石蠟油。
（7）3 000r／min 下離心 2 分鐘。應(yīng)注意柱的定向必須與*次離心時一致。
（8）將樣品放在真空干燥離心機(jī)中干燥。
（9）將干燥后的樣品貯存于—70℃下待進(jìn)行電泳。在此條件下保存1 年之久的樣品其
熒光也不會猝滅。
應(yīng)注意的是，Centri-sep 柱體可反復(fù)使用多次。每次使用過后，要用自來水洗3 次，蒸
餾水洗 2 次，然后倒置于一試管架上晾干后，稱取 50mg Cephadex G-50（Sigma，＃9048719）
放入其中，即可再行使用。
4 電泳
使用ABI 公司的377 型全自動DNA 序列分析儀電泳，并記錄序列數(shù)據(jù)。控制軟件為
PRIM377 Collection。電泳過程如下。
（1）聚丙烯酚胺凝膠濃度為4.25％，配制過程如下：
尿素 18g
Amberlite 離子交換樹脂（Sigma，MB-lA） 約39g
40％Acry mide：Bis（19:1 ）（AMRESCO，＃0496-500） 5.3ml
去離子水 25ml
將混合液在電磁攪拌器上攪拌10 分鐘。
（2）取5ml 10 倍TBE，通過2μm 濾膜抽濾后，再抽濾以上膠液。
10 倍TBE 配方：
Tris-base 108g
硼酸 55g
Na2 EDTA（2H2O） 7.44g
定容至 1L
（3）將濾過液定容至 50ml，加入 35μl TEMED 和 250μl 10％過硫酸胺（APS），輕搖
混合后，用50ml 無針頭注射器將膠注入已裝配好的玻璃板中。