DNA 連接

【資料簡介】

DNA分子的體外連接就是在一定條件下， 由DNA連接酶催化兩個雙鏈DNA片段組鄰的5’端磷酸與3’端羥基之間形成磷酸酸脂鍵的生物化學過程， DNA分子的連接是在酶切反應獲得同種酶互補序列基礎(chǔ)上進行的。
帶有相同末端（平端或粘端）的外源DNA必須克隆到具有匹配末端的線性質(zhì)粒載體中,但是在連接反應時,外源DNA和質(zhì)粒都可能發(fā)生環(huán)化,也有可能形成串聯(lián)寡聚物。因此，必須仔細調(diào)整連接反應中兩個DNA 的濃度，以便使“正確”連接產(chǎn)物的數(shù)量達到*水平，此外還常常使用堿性磷酸酶去除5’磷酸基團以抑制載體DNA的自身環(huán)化。利用T4 DNA連接酶進行目的DNA和載體的體外連接反應，也就是在雙鏈DNA 5’磷酸和相鄰的3’羥基之間形成新的共價鍵。如載體的兩條鏈都帶有5’磷酸（未脫磷），可形成4個新的磷酸二酯鍵；如載體DNA已脫磷，則只能形成2個新的磷酸二酯鍵，此時產(chǎn)生的重組DNA帶有兩個單鏈缺口，在導入感受態(tài)細胞后可被修復。